RNA dwyffordd (dsRNA) ELISA KIT

Mae'r pecyn hwn yn Assay Imiwnoorbent Cysylltiedig ag Ensym (ELISA) sy'n cyplu â system biotin-Streptavidin, ar gyfer mesur meintiol o dsRNA gyda hyd yn uwch na 60 pâr sylfaen (bp), waeth beth fo'r dilyniant.Mae'r plât wedi'i orchuddio ymlaen llaw â gwrthgorff gwrth-dsRNA.Mae dsRNA sy'n bresennol yn y sampl yn cael ei ychwanegu ac yn rhwymo i wrthgyrff sydd wedi'u gorchuddio ar y ffynhonnau.Ac yna mae gwrthgorff gwrth-dsRNA biotinylated yn cael ei ychwanegu ac yn rhwymo i dsRNA yn y sampl.Ar ôl golchi, mae HRP-Streptavidin yn cael ei ychwanegu ac yn rhwymo i'r gwrthgorff gwrth-dsRNA Biotinylated.Ar ôl deoriad caiff HRP-Streptavidin ei olchi i ffwrdd.Yna mae datrysiad swbstrad TMB yn cael ei ychwanegu a'i gataleiddio gan HRP i gynhyrchu cynnyrch lliw glas a newidiodd yn felyn ar ôl ychwanegu hydoddiant stop asidig.Mae dwysedd y melyn yn gymesur â'r swm targed o dsRNA a ddaliwyd yn y plât.Mae'r amsugnedd yn cael ei fesur ar 450 nm.

Cais

Mae'r pecyn hwn ar gyfer mesur meintiol o dsRNA gweddilliol.

Cydrannau Kit

Storio a Sefydlogrwydd

1. Ar gyfer pecyn heb ei ddefnyddio: Gellid storio'r pecyn cyfan ar 2 ~ 8 ℃ mewn oes silff.Dylid osgoi golau cryf ar gyfer sefydlogrwydd storio.

2. Ar gyfer cit a ddefnyddir: Unwaith y bydd y microplate wedi'i agor, gorchuddiwch ffynhonnau nas defnyddiwyd gyda seliwr plât a dychwelwch i'r cwdyn ffoil sy'n cynnwys y pecyn desiccant, selio sip y cwdyn ffoil a'i ddychwelyd i 2 ~ 8 ℃ cyn gynted â phosibl ar ôl ei ddefnyddio.Dylid dychwelyd adweithyddion eraill i 2 ~ 8 ℃ cyn gynted â phosibl ar ôl eu defnyddio.

Deunyddiau Angenrheidiol Ond Heb eu Cyflenwi

1. Darllenydd microplate gyda hidlydd 450 ± 10nm (gwell os gellir ei ganfod ar donfedd 450 a 650 nm).

2. ysgydwr microplate.

3. Awgrymiadau di-RNase a thiwbiau centrifuge.

Siart Llif Ymgyrch

Cyn i Chi Ddechrau

1. Dewch â holl gydrannau'r pecyn a'r samplau i dymheredd ystafell (18-25 ℃) cyn eu defnyddio.Os na fydd y pecyn yn cael ei ddefnyddio mewn un amser, dim ond stribedi ac adweithyddion i'w cymryd ar gyfer yr arbrawf presennol, a gadael y stribedi a'r adweithyddion sy'n weddill yn y cyflwr gofynnol.

2. Clustog golchi: gwanhewch 40mL o 20 × byffer golchi crynodedig gyda 760mL o ddŵr wedi'i ddad-ïoneiddio neu ddŵr distyll i baratoi 800mL o glustog golchi 1 ×.

3. safonol: troelli byr neu centrifuge yr ateb stoc cyn ei ddefnyddio.Y crynodiad o bedair safon a ddarperir yw 5ng/μL.Ar gyfer safonau UTP a pUTP dsRNA, gwanwch yr ateb stoc i 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL gyda byffer STE i lunio'r gromlin safonol.Ar gyfer safonau dsRNA N1-Me-pUTP, gwanwch yr ateb stoc i 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg / μL gyda byffer STE i dynnu'r gromlin safonol.Ar gyfer safon dsRNA 5-OMe-UTP, gwanwch yr ateb stoc i 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg / μL gyda byffer STE i dynnu'r gromlin safonol.Rydym yn argymell y gellir gwanhau safonau fel y siartiau canlynol:

4. Gwrthgorff canfod biotinylated a datrysiad gweithio HRP-streptavidin: troelli'n fyr neu allgyrchu'r datrysiad stoc cyn ei ddefnyddio.Eu gwanhau i'r crynodiad gweithio gyda byffer gwanhau.

5. TMB swbstrad: allsugno'r dos angenrheidiol o'r hydoddiant gyda chynghorion wedi'u sterileiddio a pheidiwch â thaflu'r hydoddiant gweddilliol i'r ffiol eto.Mae swbstrad TMB yn sensitif i olau, peidiwch ag amlygu swbstrad TMB i olau am amser hir.

Gan ddefnyddio protocol

1. Darganfyddwch nifer y stribedi sydd eu hangen ar gyfer yr assay.Rhowch y stribedi yn y fframiau i'w defnyddio.Dylid ailbacio'r stribedi plât sy'n weddill na ddefnyddir yn y assay hwn yn y bag gyda desiccant.Caewch y bag yn dynn ar gyfer storio oergell.

2. Ychwanegwch 100μL yr un o wanediadau o samplau safonol, gwag a samplau i'r ffynhonnau priodol.Gorchuddiwch â'r seliwr plât.Deorwch am 1 awr ar dymheredd ystafell gan ysgwyd ar 500rpm.Dylid gwanhau'r samplau gyda byffer STE i grynodiad priodol ar gyfer assay cywir.

3. cam golchi: Aspirate yr ateb a golchi gyda byffer golchi 250μL i bob ffynnon a gadael iddo sefyll am 30s.Gwaredwch byffer golchi yn gyfan gwbl trwy dorri'r plât ar bapur amsugnol.Golchwch yn llwyr 4 gwaith.

4. Ychwanegu 100μL o hydoddiant gweithio gwrthgyrff canfod biotinylated ym mhob ffynnon.Gorchuddiwch â'r seliwr plât.Deorwch am 1 awr ar dymheredd ystafell gan ysgwyd ar 500rpm.

5. Ailadrodd cam golchi.

6. Ychwanegu 100μL o hydoddiant gweithio HRP-streptavidin ym mhob ffynnon.Gorchuddiwch â'r seliwr plât.Deorwch am 30 munud ar dymheredd ystafell gan ysgwyd ar 500rpm.

7. Ailadroddwch y cam golchi eto.

8. Ychwanegu 100μL o hydoddiant swbstrad TMB ym mhob ffynnon.Gorchuddiwch â'r seliwr plât.Deorwch am 30 munud yn RT Diogelu rhag golau.Bydd yr hylif yn troi'n las trwy ychwanegu hydoddiant swbstrad.

9. Ychwanegwch 50μL o hydoddiant stop ym mhob ffynnon.Bydd yr hylif yn troi'n felyn trwy ychwanegu hydoddiant stop.Yna rhedeg y darllenydd microplate a chynnal mesuriad ar 450nm ar unwaith.

Cyfrifo'r Canlyniadau

1. Cyfartaledd y darlleniadau dyblyg ar gyfer pob safon, rheolaeth, a samplau a thynnu'r dwysedd optegol safonol sero ar gyfartaledd.Lluniwch gromlin safonol gydag amsugnedd ar yr echelin fertigol(Y) a chrynodiad dsRNA ar yr echelin lorweddol (X）.

2. Argymhellir perfformio'r cyfrifiad gyda meddalwedd gosod cromlin cyfrifiadurol fel arbenigwr cromlin 1.3 neu ELISA Calc mewn model ffit aflinol paramedr 5 neu 4.

Perfformiad

1. Sensitifrwydd:

terfyn canfod isaf: ≤ 0.001pg/μL (ar gyfer UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (ar gyfer 5-OMe-UTP-dsRNA).

terfyn meintioli is: 0.0156 pg/μL (ar gyfer UTP-, pUTP-dsRNA), 0.0312 pg/μL (ar gyfer N1-Me-pUTP-dsRNA), 0.0625 pg/μL (ar gyfer 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. trachywiredd: CV o Intra-Assay ≤10%, CV o Inter-Assay ≤10%

3. Adfer: 80% ~ 120%

4.Linerity:0.0156-0.5pg/μL(ar gyferUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(ar gyferN1-Me-pUTP dsRNA),0.0625-1pg/μL(ar gyfer 5-OMe-UTP-dsRNA).

Ystyriaethau

1. Mae tymheredd ac amser adwaith TMB yn hollbwysig, rheolwch nhw yn unol â'r cyfarwyddyd yn llym.

2. Er mwyn cyflawni atgynyrchioldeb a sensitifrwydd assay da, mae golchi'r platiau'n iawn i gael gwared ar adweithyddion gormodol heb adweithio yn hanfodol.

3. Dylai'r holl adweithyddion gael eu cymysgu'n drylwyr cyn eu defnyddio ac osgoi bumbles wrth ychwanegu sampl neu adweithyddion.

4. Os yw crisialau wedi ffurfio yn y byffer golchi crynodedig (20x), cynheswch i 37 ℃ a chymysgwch yn ysgafn nes bod y crisialau wedi toddi'n llwyr.

5. Osgoi assay samplau sy'n cynnwys Sodiwm Asid (NaN3), gan y gallai ddinistrio'r gweithgaredd HRP gan arwain at danamcangyfrif faint o dsRNA.

6. Osgoi halogiad RNase yn ystod assay.

7. Gellir cynnal y safon/sampl, gwrthgorff canfod a SA-HRP hefyd yn RT heb ysgwyd, ond gall hyn achosi gostyngiad o un-plyg yn y sensitifrwydd canfod.Ar gyfer yr achos hwn, rydym yn argymell y dylid gwanhau safonau UTP a pUTP dsRNA o 2pg / μL, dylid gwanhau safonau dsRNA N1-Me-pUTP o 4pg / μL a safon dsRNA 5-OMe-UTP o 8pg / μL.Yn ogystal, deor hydoddiant gweithio HRP-streptavidin am 60 munud ar dymheredd ystafell.Peidiwch â defnyddio ysgydwr fflasg, oherwydd gall ysgydwr fflasg arwain at ganlyniad anghywir.

Canlyniad nodweddiadol

1. Data cromlin safonol

2. cyfrifiad cromlin safonol

3. Amrediad canfod leinin: 0.0312- 1pg/μL