Pecyn Maxi Plasmid EndoFree
Mae'r pecyn hwn yn addas ar gyfer echdynnu o 150 - 300 ml o hydoddiant bacteriol wedi'i feithrin dros nos, gan ddefnyddio dull lysis alcalïaidd SDS-well i lyse'r bacteria.Mae'r dyfyniad crai yn cael ei gyfuno'n ddetholus â Chwalwr Endotoxin unigryw a'i wahanu gan allgyrchiad i gael gwared ar endotocsinau.Yna, mae'r bilen gel silica yn rhwymo'n ddetholus i DNA plasmid yn yr hydoddiant o dan amodau halen uchel a pH isel.Dilynir hyn gan ychwanegu byffer golchi i gael gwared ar amhureddau a chydrannau bacteriol eraill.Yn olaf, defnyddir byffer elution isel mewn halen, pH uchel i eliwtio DNA plasmid pur o'r bilen matrics silicon.Mae'r bilen gel silica yn cyflogi bilen arsugniad arbennig, ac mae'r gwahaniaeth swm arsugniad rhwng y golofn a'r golofn yn fach iawn ac mae'r ailadroddadwyedd yn dda.Nid oes angen ffenol, clorofform ac adweithyddion gwenwynig eraill, ac nid yw camau dyddodiad ethanol ychwaith.Gellir defnyddio'r pecyn hwn i echdynnu 0.2 -1.5 mg o DNA plasmid copi uchel pur yn gyflym, gyda chyfradd echdynnu o 80% -90%.Mae'r pecyn yn defnyddio fformiwla broses unigryw sy'n tynnu endotoxin, mae cynnwys endotoxin yn hynod o isel ac mae'r effaith trawsnewid celloedd yn ardderchog.Gellid defnyddio'r plasmid a echdynnwyd yn uniongyrchol mewn treuliad ensymau, PCR, trawsgrifio in vitro, trawsnewid, dilyniannu ac arbrofion bioleg moleciwlaidd eraill.
Amodau storio
Dylid storio RNAseA ar -30 ~ -15 ℃ a'i gludo ar ≤0 ℃.
Gellir storio Sborion Endotoxin ar 2 ~ 8 ℃ am fis, ei storio ar -30 ~ -15 ℃ ar gyfer storio hirdymora'i gludo ar ≤0 ℃.
Dylid storio cydrannau eraill ar dymheredd ystafell (15 ~ 25 ℃) a'u cludo ar dymheredd ystafell.
Cydrannau
| Cydrannau | 10RXNS |
| RNase A | 750 μL |
| Clustog P1 | 75 ml |
| Clustog P2 | 75 ml |
| Clustog P4 | 75 ml |
| Crafu Endotoxin | 25 ml |
| Clustog PW | 2 × 22 ml |
| TB byffer | 20 ml |
| Colofnau Maxi DNA FastPure (Pob un mewn Tiwb Casglu 50ml) | 10 |
| Tiwb Casglu Di-endotocsin | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, a ddefnyddir i dynnu RNA.
Clustog P1:byffer ataliad bacteriol, ychwanegu RNAseA i Buffer P1 cyn ei ddefnyddio gyntaf.
Clustog P2:byffer lysis bacteriol (yn cynnwys SDS/NaOH).
Clustog P4:niwtraleiddio byffer.
Sborion endotocsin:tynnu endotoxin o'r echdyniad plasmid crai yn effeithiol.
Clustog PW:byffer golchi, ychwanegwch y cyfaint penodedig o ethanol cyn ei ddefnyddio gyntaf.
TB byffer:byffer elution.
Colofnau DNA Maxi FastPure:colofnau arsugniad DNA plasmid.
Tiwbiau Casglu 50 ml:tiwbiau casglu hidlo.
Tiwb Casglu Di-endotocsin:tiwbiau casglu DNA plasmid.
Deunyddiau Parod
Ethanol absoliwt, isopropanol, tiwbiau centrifuge gwaelod crwn 50 ml a 50 ml heb endotocsintiwbiau centrifuge.
Ceisiadau
Mae'r cynnyrch hwn yn addas ar gyfer echdynnu plasmidau ar raddfa fawr o 150 - 300 ml o hydoddiant bacterioldiwylliedig dros nos.
Proses Arbrawf
1. Cymerwch 150 – 200 ml (dim mwy na 300 ml) o hydoddiant bacteriol wedi'i feithrin dros nos a allgyrchydd yntua 11,000 rpm (12,000 × g) am 1 – 2 funud.Taflwch y supernatant a chasglu bacteria.
Δ Wrth gasglu mwy na 50 ml o hydoddiant bacteriol, gellir casglu'r bacteria trwy ychwanegu hydoddiant bacteriol, centrifugation, taflu'r supernatant a chamau eraill yn yr un tiwb 50 ml ar gyfer
sawl gwaith.
2. Ychwanegu 7.5 ml o Byffer P1 (gwiriwch a yw RNAseA wedi'i ychwanegu at Buffer P1) i'r centrifugetiwb sy'n cynnwys bacteria a chymysgu'n drylwyr trwy fortecs neu bibellu.
Δ Mae ailddechrau bacteria yn gyfan gwbl yn y cam hwn yn hanfodol i'w gynhyrchu, ac ni ddylai fod unrhyw glwmpiau bacteriol ar ôl ail-ddarlledu.Os oes clystyrau bacteriol nad ydynt wedi'u cymysgu'n drylwyr, bydd yn effeithio ar y lysis, gan arwain at gynnyrch isel a phurdeb.Os yw'r OD600 o hydoddiant bacteriol yn 0.65, argymhellir defnyddio 7.5 ml o Buffer P1 wrth echdynnu o 150 ml o hydoddiant bacteriol;pan fo OD600 yn 0.75, dylid defnyddio 8 ml o Buffer P1 a dylid newid cyfeintiau Byfferau P2 a P4 yn unol â hynny.Os cynyddir cyfaint yr hydoddiant bacteriol i 200 ml, argymhellir bod ycynyddu nifer y Byfferau P1, P2, a P4 yn gymesur.
3. Ychwanegwch 7.5 ml o Buffer P2 at y daliant bacteriol o gam 2 a chymysgwch yn ysgafn i fyny ac i lawr ar gyfer 6 – 8amseroedd a deor ar dymheredd ystafell am 4-5 munud.
Δ Gwrthdroi yn ysgafn i gymysgu'n drylwyr.Bydd vortexing yn achosi'r darniad DNA genomig, gan arwain at ddarnau DNA genomig yn y plasmid a echdynnwyd.Ar yr adeg hon, mae'r hydoddiant yn dod yn gludiog ac yn dryloyw, gan ddangos bod y bacteria wedi'i lysu'n llawn.Ni ddylai'r hyd fod yn fwy na 5 munud er mwyn osgoi dinistrio'r plasmidau.Os nad yw'r ateb yn glir, efallai y bydd gormod o facteria yn arwain atlysis anghyflawn, felly dylid lleihau faint o facteria yn briodol.
4. Ychwanegwch 7.5 ml o Buffer P4 i'r daliant bacteriol o gam 3 a gwrthdroi'n raddol 6 – 8 gwaith ar unwaith i ganiatáu i'r hydoddiant niwtraleiddio Buffer P2 yn llwyr.Ar yr adeg hon, dylai gwaddod flocculent gwyn ymddangos.Allgyrchu ar fwy na thua 11,000 rpm (12,000 × g) am 10 - 15 munud, pippetwch y supernatant yn ofalus i mewn i diwb centrifuge gwaelod crwn 50 ml newydd (hunan-baratoi), ac osgoiaspirate y gwaddod gwyn arnofiol.
Δ Ychwanegu Buffer P4 a gwrthdroi ar unwaith i gymysgu'n dda.Gadewch y tiwb i sefyll nes bod y gwaddod gwyn wedi'i ddosbarthu'n gyfartal trwy'r hydoddiant i atal cynhyrchu dyddodiad lleol a allai effeithio ar niwtraliad.Os nad oes gwaddod flocculent gwyn unffurf cyn centrifugation ac nid yw'r supernatant yn glir ar ôl centrifugation, gall y tiwb fodwedi'i allgyrchu am 5 munud arall.
5. Ychwanegwch 0. 1 gwaith cyfaint (10% o gyfaint uwchnatur, tua 2.2 ml) o Sborion Endotoxin i'r uwchnatydd o gam 4 a gwrthdro i gymysgedd.Rhowch yr hydoddiant mewn baddon iâ neu ei roi mewn iâ wedi'i falu (neu rewgell oergell) am 5 munud nes bod yr hydoddiant yn newid o fod yn gymylog i fod yn glir ac yn dryloyw (neu'n llonydd.ychydig yn gymylog), ac yn achlysurol yn cymysgu sawl gwaith.
Δ Ar ôl ychwanegu'r Sborion Endotocsin at y supernatant, bydd y supernatant yn troi'n gymylog ond bydd ydylai uwchnatant ddod yn glir (neu ychydig yn gymylog) ar ôl oeri yn y baddon iâ.
6. Ar ôl gosod y supernatant ar dymheredd ystafell (> 25 ℃) am 10 - 15 munud, bydd yn dod yn gymylog felmae ei dymheredd yn cynyddu i dymheredd ystafell.Yna dylai'r supernatant gael ei wrthdroi i gymysgu.
Δ Os yw tymheredd yr ystafell yn is neu os ydych am leihau'r amser echdynnu, gellir deor y supernatant mewn baddon dŵr 37 ~ 42 ℃ am 5 - 10 munud a gellir cymryd y cam nesaf ar ôl y supernatantyn dod yn gymylog.
7. Allgyrchu'r uwchnatur tua 11,000 rpm (12,000 × g) am 10 munud ar dymheredd ystafell (rhaid i'r tymheredd fod yn >25 ℃) i wahanu'r cam.Mae'r cyfnod dyfrllyd uchaf yn cynnwys y DNA tra bod haen isaf y cyfnod olewog glas yn cynnwys endotocsin ac amhureddau eraill.Trosglwyddwch yCyfnod dyfrllyd sy'n cynnwys DNA i diwb newydd ataflu'r haenen olewog.
Δ Rhaid i'r tymheredd yn ystod centrifugio fod dros 25 ℃ gan nad yw gwahanu cyfnod effeithiol yn ei wneuddigwydd os yw'r tymheredd yn rhy isel.
Δ Os nad yw'r gwahaniad cam yn effeithiol, gellir addasu'r tymheredd centrifugation i 30 ℃ agellir cynyddu amser y centrifugation i 15 munud.
Δ Peidiwch â sugno'r haen olewog las gan ei fod yn cynnwys endotocsin ac amhureddau eraill.
Mecanwaith
Niwtraleiddio Lysis Ail-ddarlledu
◇ Ychwanegu 7.5 ml Byffer P1
◇ Ychwanegu 7.5 ml Byffer P2
◇ Ychwanegu 7.5 ml Byffer P4
Dileu endotocsin
◇ Ychwanegu 0. 1 gwaith y cyfaint supernatant o Endotoxin Scavenger
Rhwymo a Golchi
◇ Ychwanegwch 0.5 gwaith cyfaint yr isopropanol
◇ Ychwanegu 10 ml Clustogi PW
◇ Ychwanegu 10 ml Clustogi PW
Elution
◇ Ychwanegwch 1 – 2 ml Clustog TB neu ddH2O heb Endotocsin
