mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Roedd Cap 2’ -O-methyltransferase yn deillio o straen E. coli ailgyfunol sy’n cario’r genyn ar gyfer y vaccinia mRNA Cap 2 ’-O-Methyltransferase.Mae’r ensym hwn yn adio grŵp methyl yn safle 2’-O y niwcleotid cyntaf gerllaw adeiledd y cap ar 5’pen yr RNA. Mae’r ensym yn defnyddio S-adenosylmethionine (SAM) fel rhoddwr methyl i RNA wedi’i gapio â methylad (cap -0) gan arwain at strwythur cap-1.

Gall strwythur Cap1 gynyddu effeithlonrwydd cyfieithu, gan wella mynegiant mRNA mewn arbrofion trawsyrru a micro-chwistrellu. Mae'r ensym hwn yn gofyn yn benodol am RNA gyda chap m7GpppN fel swbstrad.Ni all ddefnyddio RNA gyda pN, ppN, pppN neu GpppN ar y pen 5´.Gellir paratoi RNA wedi'i gapio trwy drawsgrifio in vitro gan ddefnyddio analog cap neu drwy gapio ensymatig gan ddefnyddio Ensym Capio Vaccinia.

Cydrannau

mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase (50U/μL)

10 × Clustogi Ymateb Capio

Storio

-25 ～- 15 ℃ ar gyfer storio (Osgoi cylchoedd rhewi-dadmer dro ar ôl tro）

Clustog storio

20 mM Tris-HCl （pH 8.0 ， 25 ℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100 ， 50% glyserol.

Diffiniad uned

Diffinnir un uned fel faint o ensym sydd ei angen i fethyleiddio 10 pmol o drawsgrifiad RNA wedi'i gapio 80 nt mewn 1 awr ar 37°C.

Profion rheoli ansawdd

Exonuclease:50U o mRNA Cap 2 ' -O-Methyltransferase gyda 1μg λ-Hind III dreulio DNA ar 37 ℃ am 16 awr yn cynhyrchu dim diraddio fel y pennir gan electrofforesis gel agarose.

Endonuclease: 50 U o mRNA Cap 2 ' -O-Methyltransferase gyda 1 μg λDNA ar 37 ℃ am 16 awr yn cynhyrchu dim diraddio fel y pennir gan electrofforesis gel agarose.

Nickase: 50U o mRNA Cap 2 ’ -O-Methyltransferase gyda 1μg pBR322 ar 37 ℃ am 16 awr yn ildio dim diraddio fel y penderfynir gan electrofforesis gel agarose.

RNase: 50U o mRNA Cap 2 ’ -O-Methyltransferase gyda RNA 1.6μg MS2 am 4 awr ar 37 ℃ yn cynhyrchu dim diraddio fel y penderfynir gan electrofforesis gel agarose.

E. coli DNA: 50U o mRNA Cap 2 ’ -O-Methyltransferase yn cael ei sgrinio am bresenoldebE. coli DNA genomig gan ddefnyddio TaqMan qPCR gyda paent preimio penodol ar gyfer yE. coli 16S locws rRNA.Mae'rE. coli halogiad DNA genomig yw =1E. coli genom.

Bacteraidd Endotocsin: LAL-brawf, yn ôl rhifyn 2020 Pharmacopoeia IV Tsieineaidd, dull prawf terfyn gel, rheol gyffredinol (1143).Dylai cynnwys endotocsin bacteriol fod yn = 10 EU/mg.

System ymateb ac amodau

1. Cyfunwch swm priodol o RNA wedi'i Gapio a H2O di-RNase mewn tiwb microfuge 1.5 mL i gyfaint terfynol o 16.0 µL.

2. Cynheswch ar 65 ℃ am 5 munud ac yna baddon iâ am 5 munud.

3. Ychwanegwch y cydrannau canlynol yn y drefn a nodir (ar gyfer methylation RNA wedi'i Gapio

llai na 10

* 10 × Clustogi Ymateb Capio: 500 mM Tris-HCl (pH 8.0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. Deorwch ar 37 ℃ am 1 awr (argymhellir 2 awr o ddeor ar gyfer y darn targed llai na 200 nt).

Ceisiadau

Gwella mynegiant mRNA yn ystod arbrofion micro-bigiad a thrawsnewid.

Nodiadau ar ddefnydd

1. Cyn adwaith, dylai RNA gael ei buro a'i hydoddi mewn dŵr di-niwclease, ni ddylai'r holl atebion gynnwys unrhyw EDTA ac ïonau.

2. Argymhellir cynhesu'r sampl RNA ar 65 ℃ am 5 munud cyn yr adwaith i gael gwared ar y strwythur eilaidd ar 5´pen y trawsgrifiad.Gellid ei ymestyn i 10 munud ar gyfer strwythur 5 ’-terminal cymhleth.