PNGase F
Peptid-N-Glycosidase F (PNGase F) yw'r dull ensymatig mwyaf effeithiol ar gyfer tynnu bron pob oligosacaridau sy'n gysylltiedig â N o glycoproteinau.Mae PNGase F yn amidase, sy'n hollti rhwng y rhan fwyaf o weddillion GlcNAc mewnol ac asparagin o oligosaccharidau mannose uchel, hybrid, a chymhleth o glycoproteinau sy'n gysylltiedig â N.
Cais
Mae'r ensym hwn yn ddefnyddiol ar gyfer tynnu gweddillion carbohydradau o broteinau.
Paratoi a manyleb
| Ymddangosiad | Hylif Di-liw |
| Purdeb protein | ≥95% (o SDS-PAGE) |
| Gweithgaredd | ≥500,000 U/mL |
| Ecsoglycosidase | Ni ellid canfod unrhyw weithgaredd (ND) |
| Endoglycosidase F1 | ND |
| Endoglycosidase F2 | ND |
| Endoglycosidase Dd3 | ND |
| Endoglycosidase H | ND |
| Proteas | ND |
Priodweddau
| Rhif CE | 3.5.1.52(Ailgyfunol o ficro-organeb) |
| Pwysau moleciwlaidd | 35 kDa (SDS-TUDALEN) |
| Pwynt isoelectrig | 8. 14 |
| pH optimwm | 7.0-8.0 |
| Tymheredd gorau posibl | 65 °C |
| Penodoldeb swbstrad | Hollti bondiau glycosidig rhwng GlcNAc a gweddillion asparagin Ffig.1 |
| Safleoedd cydnabod | Glysanau sy'n gysylltiedig â N oni bai eu bod yn cynnwys α1-3 ffycos Ffig. 2 |
| Actifyddion | DTT |
| Atalydd | SDS |
| Tymheredd storio | -25 ~-15 ℃ |
| Anactifadu Gwres | Mae cymysgedd adwaith 20µL sy'n cynnwys 1µL o PNGase F yn cael ei anactifadu trwy ddeor ar 75 °C am 10 munud. |
Ffig. 1 Penodoldeb swbstrad PNGase F
Ffig. 2 Cydnabod PNGase F.
Pan fydd y gweddillion GlcNAc mewnol wedi'u cysylltu â α1-3 ffycose, ni all PNGase F hollti oligosacaridau sy'n gysylltiedig â N o glycoproteinau.Mae'r addasiad hwn yn gyffredin mewn planhigion a rhai glycoproteinau pryfed.
Cgwrthwynebwyr
|
| Cydrannau | Crynodiad |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | Clustogi dadnatureiddio Glycoprotein 10 × | 1000 µl |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Diffiniad uned
Diffinnir un uned(U) fel swm yr ensym sydd ei angen i dynnu >95% o'r carbohydrad o 10 µg o RNase B dadnatureiddiedig mewn 1 awr ar 37°C mewn cyfanswm cyfaint adwaith o 10 µL.
Amodau ymateb
1.Diddymu 1-20 µg o glycoprotein gyda dŵr wedi'i ddadïoneiddio, ychwanegu 1 µl 10 × Glycoprotein Dadnatureiddio Byffer a H2O (os oes angen) i wneud cyfaint adwaith cyfanswm o 10 µl.
2.Deorwch ar 100°C am 10 munud, a'i oeri ar rew.
3.Ychwanegu 2 µl 10 × GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 a chymysgu.
4.Ychwanegu 1-2 µl PNGase F a H2O (os oes angen) i wneud cyfaint adwaith cyfanswm o 20 µl a chymysgu.
5.Deor adwaith ar 37°C am 60 munud.
6.Ar gyfer dadansoddiad SDS-PAGE neu ddadansoddiad HPLC.
