Ensym Capio Feirws Vaccinia

Mae ensym capio firws Vaccinia yn deillio o straen E. coli ailgyfunol sy'n cario'r genynnau ar gyfer yr ensym capio Vaccinia.Mae'r ensym sengl hwn yn cynnwys dwy is-uned (D1 a D12) ac mae ganddo dri gweithgaredd ensymatig (RNA triphosphatase a guanylyltransferase gan yr is-uned D1 a guanine methyltransferase gan yr is-uned D12).Mae Ensym Capio firws Vaccinia yn effeithiol i gataleiddio ffurfio strwythur cap, a all atodi'r strwythur cap 7-methylguanylate (m7Gppp, Cap 0) yn benodol i ddiwedd RNA 5′.Mae strwythur cap (Cap 0) yn chwarae rhan bwysig mewn sefydlogi mRNA, ei gludo a'i gyfieithu mewn ewcaryotau.Mae capio RNA trwy adwaith ensymatig yn ddull effeithiol a syml a all wella'n sylweddol sefydlogrwydd a chyfieithiad RNA ar gyfer trawsgrifio in vitro, trawsgludiad a micro-bigiad.

Cydrannau

Ensym Capio Feirws Vaccinia (10 U/μL)

10 × Clustogi Capio

Amodau storio

-25 ～- 15 ℃ ar gyfer storio (Osgoi cylchoedd rhewi-dadmer dro ar ôl tro）

Clustog storio

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0. EDTA 1mM, 0. 1% Triton X- 100, glyserol 50%.

Diffiniad Uned

Diffinnir un uned o Ensym Capio firws Vaccinia fel faint o ensym sydd ei angen i ymgorffori 10pmol o GTP mewn trawsgrifiad 80nt mewn 1 awr ar 37°C.

Rheoli Ansawdd

Exonuclease:Mae 10U o Ensym Capio firws Vaccinia gyda 1μg λ-Hind III yn treulio DNA ar 37 ℃ am 16 awr yn cynhyrchu dim diraddio fel y'i pennir gan electrofforesis gel agarose.

Endonuclease:Nid yw 10U o Ensym Capio firws Vaccinia gyda 1μg λDNA ar 37 ℃ am 16 awr yn cynhyrchu unrhyw ddiraddiad fel y'i pennir gan electrofforesis gel agarose.

Nickase:Nid yw 10U o Ensym Capio firws Vaccinia gyda 1 μg pBR322 ar 37 ℃ am 16 awr yn cynhyrchu unrhyw ddiraddio fel y'i pennir gan electrofforesis gel agarose.

RNase:Nid yw 10U o Ensym Capio firws Vaccinia gyda 1.6μg MS2 RNA am 4 awr ar 37 ℃ yn cynhyrchu unrhyw ddiraddiad fel y'i pennir gan electrofforesis gel agarose.

1.DNA coli:Mae 10U o Ensym Capio firws Vaccinia yn cael ei sgrinio am bresenoldeb DNA genomig E. coli gan ddefnyddio TaqMan qPCR gyda phrimwyr sy'n benodol ar gyfer y locws rRNA E. coli 16S.Yr halogiad DNA genomig E. coli yw≤1 genom E. coli.

2.Bacteraidd Endotocsin: LAL-prawf, yn ôl rhifyn Tsieineaidd Pharmacopoeia IV 2020, dull prawf terfyn gel, rheol gyffredinol (1143).Dylai cynnwys endotocsin bacteriol fod yn ≤10 EU/mg.

System ymateb ac amodau

1. Protocol Capio (cyfaint adwaith: 20 μL)

Mae'r weithdrefn hon yn berthnasol i adwaith capio RNA 10μg (≥100 nt) a gellir ei raddio yn unol â gofynion arbrofol.

I) Cyfunwch 10μg RNA a H2O Di-Niwcleas mewn tiwb microfuge 1.5 ml i gyfaint terfynol o 15.0 µL.*10 × Clustogi Capio: 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8.0)

2) Cynheswch ar 65 ℃ am 5 munud ac yna bath iâ am 5 munud.

3) Ychwanegwch y cydrannau canlynol yn y drefn a nodir

*10 × Clustogi Capio: 0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH8.0)

4) Deorwch ar 37 ° C am 30 munud, mae RNA bellach wedi'i gapio ac yn barod ar gyfer cymwysiadau i lawr yr afon.

2. terfynell 5′ adwaith labelu (cyfaint ymateb: 20 μL)

Mae’r protocol hwn wedi’i gynllunio i labelu RNA sy’n cynnwys triffosffad 5’ a gellir ei raddio yn ôl y galw.Bydd effeithlonrwydd ymgorffori label yn cael ei effeithio gan gymhareb molar RNA: GTP, yn ogystal â chynnwys GTP mewn samplau RNA.

1) Cyfunwch swm priodol o RNA a H2O Di-Niwcleas mewn tiwb microfuge 1.5 ml i gyfaint terfynol o 14.0 µL.

2) Cynheswch ar 65 ℃ am 5 munud ac yna bath iâ am 5 munud.

3) Ychwanegwch y cydrannau canlynol yn y drefn a nodir.

** Mae GTP MIX yn cyfeirio at GTP a nifer fach o farcwyr.Am y crynodiad o GTP, cyfeiriwchi Nodyn 3.

4) Deorwch ar 37°C am 30 munud, mae diwedd RNA 5′ bellach wedi'i labelu ac yn barod ar gyfer i lawr yr afon

Ceisiadau

1. Capio mRNA cyn profion cyfieithu/cyfieithu in vitro

2. Labelu 5´ diwedd mRNA

Nodiadau ar ddefnydd

1.Mae gwresogi hydoddiant RNA cyn deori gyda'r Vaccinia Capping Enzyme yn cael gwared ar adeiledd eilaidd ar 5´pen y trawsgrifiad.Ymestyn yr amser i 60 munud ar gyfer trawsgrifiadau gyda phwynt tra strwythuredig hysbys.

2. Dylid puro RNA a ddefnyddir ar gyfer adweithiau capio cyn ei ddefnyddio a'i hongian mewn dŵr heb niwcleas.Ni ddylai EDTA fod yn bresennol a dylai'r hydoddiant fod yn rhydd o halwynau.

3. Ar gyfer labelu'r pen 5´, dylai cyfanswm y crynodiad GTP fod tua 1-3 gwaith y crynodiad molar o mRNA yn yr adwaith.

4. Gellir graddio cyfaint y system adwaith i fyny neu i lawr yn ôl y gwirioneddol.