M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Mae Neoscript Reverse Transcriptase yn drawsgrifiad gwrthdro a geir trwy sgrinio'r genyn M-MLV o darddiad firws lewcemia Moloney murine a mynegiant yn E.coli.Mae'r ensym yn dileu gweithgaredd RNase H, mae ganddo oddefgarwch tymheredd uwch, ac mae'n addas ar gyfer trawsgrifio gwrthdro tymheredd uchel.Felly, mae'n ddefnyddiol dileu effeithiau anffafriol strwythur lefel uchel RNA a ffactorau nad ydynt yn benodol ar synthesis cDNA, ac mae ganddo sefydlogrwydd uwch a gallu synthesis trawsgrifio gwrthdro.Mae gan yr ensym sefydlogrwydd uwch a gallu synthesis trawsgrifio gwrthdro.
Cydrannau
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × Clustog y Llinyn Cyntaf (dewisol)
* Nid yw Byffer Llinyn Cyntaf 5 × yn cynnwys dNTP, ychwanegwch dNTPs wrth baratoi'r system adwaith
Cais a Argymhellir
1.Un cam qRT-PCR.
2.Canfod firws RNA.
Cyflwr Storio
-20 ° C ar gyfer storio tymor hir, dylid ei gymysgu ymhell cyn ei ddefnyddio, osgoi rhewi-dadmer yn aml.
Diffiniad Uned
Mae un uned yn ymgorffori 1 nmol o dTTP mewn 10 munud ar 37°C gan ddefnyddio poly(A)•oligo(dT)25fel templed/primer.
Rheoli Ansawdd
1.purdeb electrofforetig SDS-PAGE yn fwy na 98%.
2.Sensitifrwydd ymhelaethu, rheolaeth swp-i-swp, sefydlogrwydd.
3.Dim gweithgaredd niwcleas alldarddol, dim endonuclease alldarddol neu halogiad exonuclease
Setup Adwaith ar gyfer Ateb Adwaith Cadwyn Gyntaf
1.Paratoi cymysgedd yr adwaith
| Cydrannau | Cyfrol |
| Oligo(dT)12-18 Preimiwr neu Random Primera Neu Preimio Genynnau Penodolb | 50 pmol |
| 50 pm (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Templed RNA | Cyfanswm RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| dH di-RNase2O | I 10 μL |
Nodiadau:a/b: Dewiswch wahanol fathau o preimwyr yn unol â'ch anghenion arbrofol.
2.Cynheswch ar 65°C am 5 munud ac oeri'n gyflym ar rew am 2 funud.
3.Ychwanegwch y cydrannau canlynol at y system uchod i gyfanswm cyfaint o 20µL a chymysgwch yn ysgafn:
| Cydrannau | Cyfrol (μL) |
| 5 × Clustogau Llinyn Cyntaf | 4 |
| Neoscript Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| Atalydd RNase (40 U/μL) | 1 |
| dH di-RNase2O | I 20 μL |
4.Please perfformiwch yr adwaith yn ôl yr amodau canlynol:
(1) Os defnyddir Random Primer, dylid cynnal yr adwaith ar 25 ℃ am 10 munud, ac yna ar 50 ℃ am 30 ~ 60 munud;
(2) Os defnyddir Oligo dT neu preimwyr penodol, dylid cynnal yr adwaith ar 50 ℃ am 30 ~ 60 munud.
5.Cynhesu ar 95 ℃ am 5 munud i anactifadu Neoscript Reverse Transcriptase a therfynu'r adwaith.
6.Gellir defnyddio cynhyrchion trawsgrifio gwrthdro yn uniongyrchol mewn adwaith PCR ac adwaith meintiol PCR fflworoleuedd, neu eu storio ar -20 ℃ am amser hir.
PCR Rgweithredu:
1.Paratoi cymysgedd yr adwaith
| Cydrannau | Crynodiad |
| Clustog 10 × PCR (dNTP am ddim, Mg²+ am ddim) | 1 × |
| dNTPs (10mM yr un dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Polymeras DNA Taq (5U/μL) | 2-2.5 U |
| Preimiwr 1 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| Preimiwr 2 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| Templeda | ≤10% Ateb Adwaith Cadwyn Gyntaf (2 μL) |
| ddH2O | I 50 μL |
Nodiadau:a: Os ychwanegir gormod o doddiant adwaith cadwyn cyntaf, efallai y bydd yr adwaith PCR yn cael ei atal.
2.Gweithdrefn Ymateb PCR
| Cam | Tymheredd | Amser | Beiciau |
| Cyn-denatureiddio | 95 ℃ | 2-5 munud | 1 |
| Dadnatureiddio | 95 ℃ | 10-20 eiliad | 30-40 |
| Anelio | 50-60 ℃ | 10-30 eiliad | |
| Estyniad | 72 ℃ | 10-60 eiliad |
Nodiadau
1.Yn addas ar gyfer optimeiddio tymheredd trawsgrifio gwrthdro yn yr ystod o 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.Mae ganddo sefydlogrwydd gwell, mae'n addas ar gyfer ymhelaethu trawsgrifio gwrthdro tymheredd uchel.Yn ogystal, mae'n ffafriol i basio'n effeithlon trwy ranbarthau strwythurol cymhleth RNA.Hefyd, mae'nyn addas ar gyfer canfod fflworoleuedd amlblecs un-cam meintiol RT-PCR.
3.Cydnawsedd da ag amrywiol ensymau ymhelaethu PCR ac mae'n addas ar gyfer adweithiau RT-PCR sensitifrwydd uchel.
4.Addas ar gyfer sensitifrwydd uchel fflworoleuedd un cam adwaith meintiol RT-PCR, effeithiol wella cyfradd canfod crynodiad isel o dempledi.
5.Yn addas ar gyfer adeiladu llyfrgell cDNA.
