M-MLV Reverse Transcriptase
Mae RevScript Reverse transcriptase yn cael ei sicrhau gan dechnoleg peirianneg enetig.Mae ganddo allu synthesis cDNA uwch, sefydlogrwydd thermol a therfyn tymheredd adwaith (hyd at 60 ° C).Mae'r cynnyrch cDNA wedi'i syntheseiddio hyd at 10 kb.Mae'n gwella affinedd y templedi ac mae'n addas ar gyfer trawsgrifio gwrthdro o dempledi RNA gyda strwythur eilaidd cymhleth neu enynnau copi isel.
Cydrannau
| Cydran | HC2003B-01 (10,000U) | HC2003B-02 (5*10,000U) | HC2003B-03 (200,000U) |
| RevScript Reverse Transcriptase (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 ml |
| 5 × Clustog RevScript | 250 μL | 1.25 ml | 5 mL |
Cyflwr Storio
Dylid storio'r cynnyrch hwn ar -25 ° C ~ -15 ° C am 2 flynedd.
Diffiniad Uned
Mae un uned yn ymgorffori 1 nmol o dTTP mewn deunydd anhydawdd asid mewn 10 munud ar 37°C gan ddefnyddio Oligo(dT) fel paent preimio.
Gosod Adwaith
1. Dadnatureiddio templed RNA (Mae'r cam hwn yn ddewisol, mae dadnatureiddio templed RNA yn helpu i agor y strwythurau eilaidd, a fydd yn gwella cynnyrch y llinyn cyntaf cDNA.)
| Cydrannau | Cyfrol (μL) |
| RNase ddH rhad ac am ddim2O | I 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) neu Random Primer (50 μmol/L) Neu Preimio Genynnau Penodol (2 μmol/L) | 1 |
| neu 1 | |
| neu 1 | |
| Templed RNA | Xa |
Nodiadau:
1) a: Cyfanswm RNA: 1-5 ug neu mRNA: 1-500 ng
2) Deor ar 65°C am 5 munud, yna ei drosglwyddo ar rew ar unwaith i oeri am 2 funud.Centrifugio cryno i gasglu hylif adwaith, ychwanegwch yr ateb adwaith trawsgrifio gwrthdro fel y dangosir yn y tabl canlynol.Pibed yn ysgafn i gymysgu.
1.Paratoi cymysgedd yr adwaith (cyfaint 20 μL)
| Cydrannau | Cyfrol (μL) |
| Cymysgedd o'r cam blaenorol | 13 |
| 5 × Clustog | 4 |
| Cymysgedd dNTP (10nmol/L) | 1 |
| Trawsgrifiad Gwrthdroi (200 U/μL) | 1 |
| Atalydd RNase (40 U/μL) | 1 |
1.Perfformiwch yr adwaith o dan yr amodau canlynol:
| Tymheredd (°C) | Amser |
| 25 °Ca | 5 munud |
| 42 °Cb | 15-30 munud |
| 85 °Cc | 5 munud |
Nodiadau:
1) a.Mae angen deor ar 25°C am 5 munud yn unig ar gyfer defnyddio'r hecsamers ar hap.Os gwelwch yn dda hepgor y cam hwn wrth ddefnyddio Oligo (dT)18neu Genynnau Preimio Penodol.
2) b.Y tymheredd trawsgrifio cefn a argymhellir yw 42 ° C, Ar gyfer templedi â strwythurau eilaidd cymhleth neu gynnwys GC uchel, argymhellir codi'r tymheredd adwaith i 50-55 ° C.
3) c.Gwresogi ar 85°C am 5 munud i anactifadu trawsgrifiad gwrthdro.
4) Gellir defnyddio'r cynnyrch yn uniongyrchol mewn adweithiau PCR neu qPCR, neu ei storio ar -20 ° C ar gyfer storio tymor byr.Argymhellir aliguot y cynhyrchion a'u storio ar -80 ° C ar gyfer storio tymor hir.Osgoi rhewi-dadmer yn aml.
5) Mae'r cynnyrch yn addas ar gyfer un-cam RT-qPCR, argymhellir ychwanegu 10-20 U gwrthdroi transcriptase ar gyfer pob system adwaith 25μL, neu gynyddu'n raddol swm y transcriptase gwrthdro yn ôl y sefyllfa wirioneddol.
Nodiadau
1.Cadwch yr ardal arbrofol yn lân;Dylid gwisgo menig a masgiau glân yn ystod y llawdriniaeth.Dylai'r holl nwyddau traul a ddefnyddir yn yr arbrawf fod yn rhydd o RNase i atal halogiad RNase.
2.Dylid perfformio pob gweithdrefn ar rew i atal diraddio RNA.
Argymhellir samplau RNA o ansawdd 3.High i sicrhau effeithlonrwydd uchel o drawsgrifio gwrthdro.
4.Mae'r cynnyrch hwn ar gyfer defnydd ymchwil yn unig.
5.Please gweithredu gyda chotiau labordy a menig tafladwy, er eich diogelwch.
