Glycosylase DNA Uracil
Mae Glycosylase Uracil-DNA (UNG neu UDG) yn glôn ailgyfunol o E.coli gyda phwysau moleciwlaidd o 25 kDa.Mae'n cataleiddio rhyddhau uracil rhad ac am ddim o DNA un llinyn a llinyn dwbl sy'n cynnwys uracil, ac mae'n anactif yn erbyn RNA, a gellir ei ddefnyddio i atal halogi cynhyrchion ymhelaethu PCR.Mae'r egwyddor o weithredu yn seiliedig ar y ffaith, os amnewidir dUTP yn lle dTTP yn yr adwaith PCR a bod cynnyrch ymhelaethu PCR sy'n cynnwys basau du yn cael ei ffurfio, gall yr ensym dorri'n ddetholus bond glycosidig basau U mewn un edefyn a llinyn dwbl. DNA a diraddio'r cynnyrch ymhelaethu PCR.
Cais a Argymhellir
Helaethiad Atal Halogiad
Cyflwr Storio
-20 ° C ar gyfer storio tymor hir, dylid ei gymysgu ymhell cyn ei ddefnyddio, osgoi rhewi-dadmer yn aml.
Clustog storio
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, EDTA 1 mM, 1 mM DTT, Stabilizer, 50% Glyserol.
Diffiniad Uned
Swm yr ensym sydd ei angen i ddiraddio 1µg o DNA un edefyn sy'n cynnwys basau dU mewn 1 awr ar 37°C yw 1 uned.
Rheoli Ansawdd
1.purdeb electrofforetig SDS-PAGE yn fwy na 98%
2.Sensitifrwydd ymhelaethu, rheolaeth swp-i-swp, sefydlogrwydd
3.Ar ôl i 1U o UNG gael ei drin ar 50 ℃ am 2 funud, dylai'r templed sy'n cynnwys U o dan 103 copi gael ei ddiraddio'n llwyr ac ni ellir cynhyrchu unrhyw gynnyrch ymhelaethu.
4.Dim gweithgaredd niwcleas alldarddol
Cyfarwyddiadau
| Cydrannau | Cyfaint (μL) | Crynodiad terfynol |
| Clustogi 10 × PCR (dNTP am ddim, Mg²+am ddim) | 5 | 1 × |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (disodli dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1.25 U |
| 5 U/μL UNG | 0.25 (0.1-0.5) | 0.25 U (0.1-0.5) |
| 25 × Cymysgedd Primera | 2 | 1 × |
| Templed | - | ＜1μg/adwaith |
| ddH₂O | I 50 | - |
Nodyn: a: Os caiff ei ddefnyddio ar gyfer qPCR/qRT-PCR, dylid ychwanegu'r stiliwr fflwroleuol i'r system adwaith.Fel arfer, gall crynodiad primer terfynol o 0.2 μM roi canlyniadau da;pan fo'r perfformiad adwaith yn wael, gellir addasu'r crynodiad preimio yn yr ystod o 0.2-1 μM.Fel arfer, mae crynodiad y stiliwr wedi'i optimeiddio yn yr ystod o 0.1-0.3 μM.Gellir cynnal arbrofion graddiant crynodiad i ddod o hyd i'r cyfuniad gorau o baent preimio a stiliwr.
Nodiadau
1.Gellir defnyddio ensym UNG i gael gwared ar y cynhyrchion ymhelaethu dUTP halogedig o'r system adwaith cyn yr adwaith ymhelaethu PCR, yna er mwyn osgoi canlyniadau ffug-bositif oherwydd halogiad cynnyrch.
2.Yn gyffredinol, y tymheredd gorau posibl ar gyfer ensym UNG i'w ddefnyddio yn yr adwaith gwrth-halogi PCR yw 50 ℃ am 2 funud;y cyflwr anactifadu yw 95 ℃ am 5 munud.
3.Osgowch rewi-dadmer yn aml, a pheidiwch â bod yn agored i amrywiadau tymheredd mawr.
4.Mae gan wahanol enynnau i'w mwyhau effeithlonrwydd defnyddio dUTP gwahanol a sensitifrwydd i ensym UNG, felly, os yw'r defnydd o system UNG yn arwain at ostyngiad mewn sensitifrwydd canfod, dylid addasu ac optimeiddio'r system adwaith, os oes angen cymorth technegol arnoch, cysylltwch â ein cwmni.
