Pecyn Bach Echdynnu DNA
Mae'r pecyn hwn yn mabwysiadu system glustogi wedi'i optimeiddio a thechnoleg puro colofn gel silica, a all adennill darnau DNA 70 bp - 20 kb o grynodiadau amrywiol o gel agarose TAE neu TBE.Gall colofn arsugniad DNA arsugniad DNA yn arbennig o dan gyflwr halen uchel.Yn ogystal, gall y pecyn buro darnau DNA yn uniongyrchol o gynhyrchion PCR, systemau adwaith ensymatig neu gynhyrchion DNA crai a geir trwy ddulliau eraill, a chael gwared ar amhureddau fel proteinau, cyfansoddion organig eraill, ïonau halen anorganig a phremwyr oligonucleotid.Gall sicrhau y gellir cwblhau'r puro o fewn 10-15 munud.Gellir defnyddio'r DNA wedi'i buro yn uniongyrchol ar gyfer ligation, trawsnewid, treuliad ensymau, trawsgrifio in vitro, PCR, dilyniannu, micro-chwistrelliad, ac ati.
Amodau storio
Storio ar -15 ~ -25 ℃ a chludo ar dymheredd ystafell.
Cydrannau
| Cydrannau | (100 rxns) |
| CMC byffer | 80 ml |
| Clustog GW | 2 × 20 ml |
| Byffer Elution | 20 ml |
| Colofnau Bach DNA FastPure-G | 100 |
CMC byffer:byffer rhwymo DNA.
Clustog GW:Clustog golchi;ychwanegu ethanol absoliwt yn ôl y cyfaint a nodir ar y botel cyn ei ddefnyddio.
Byffer Elution:Elution.
Colofnau Bach DNA FastPure-G:Colofnau arsugniad DNA.
Tiwbiau Casglu 2 ml:Tiwbiau casglu ar gyfer hidlo.
Deunyddiau Parod
Tiwbiau sterileiddio 1.5 ml, ethanol absoliwt ac isopropanol (pan fydd darn DNA ≤100 bp, ychwanegwch 1 cyfaint
isopropanol i 1 cyfaint gel), baddon dŵr.
Proses Arbrawf
Ychwanegu 80 ml o ethanol i wanhau Buffer GW fel y nodir ar y tag cyn ei ddefnyddio, a'i storio ar dymheredd yr ystafell.
Mecanwaith
1. Ateb adwaith PCR
Cynllun echdynnu gel: Ychwanegu maint cyfartal cynllun adfer ateb adwaith CDP PCR Clustogi:Ychwanegu 5 gwaith y byffer cyfaint
2. CMC Cyfrifwch gyfaint y gel(100 μl yn hafal i 100 mg)
Hydoddwch gel
3. Cynheswch ymlaen llaw ar 50 ~ 55℃
4. Golchwch Rhwymo
Ychwanegu 300 μL o CMC Byffer*
Ychwanegu 700 μL o Buffer GW
Ychwanegu 700 μL o Buffer GW
5. Eliwt
Ychwanegu 20 – 30μL o Byffer Elution neu ddŵr wedi'i ddad-ïoneiddio
Nodiadau * Adferiad hylif adwaith PCR heb y cam hwn
Rhaglen echdynnu gel
1. Ar ôl electrofforesis DNA ar gyfer ffracsiynu darnau DNA, ecseiswch y streipen sengl o ddarn DNA o'r gel agarose o dan olau UV.Argymhellir defnyddio papur amsugnol i amsugno lleithder ymddangosiadol y gel a lleihau maint y sleisen gel trwy dynnu agarose ychwanegol ag y gallwch.Pwyswch y sleisen gel (heb diwb microcentrifuge) i gyfrifo ei gyfaint: Mae cyfaint gelslice 100 mg tua 100 μL, gan dybio bod y dwysedd yn 1g/ml.
2. Ychwanegu cyfaint cyfartal CMC clustogi, deor ar 50 ~ 55 ℃ am 7-10 munud (yn ôl maint y gel, addaswch yr amser deori nes bod y gel wedi toddi'n llwyr).Gwrthdroi'r tiwb 2 waith yn ystod y cyfnod magu.
Δ Ni fydd ychwanegu 1-3 cyfrol o GDP Buffer yn dylanwadu ar effeithlonrwydd adfer DNA.Os yw'r darn DNA i'w adennill <100 bp, mae angen ychwanegu 3 cyfrol o GDP Byffer;pan fydd y sleisen gel wedi'i diddymu'n llwyr, ychwanegwch 1 cyfaint o isopropanol a'i gymysgu'n drylwyr, yna ewch ymlaen i'r cam nesaf.
3. Centrifuge yn fyr i ddod â'r sampl i waelod y tiwb, mewnosodwch y DNA FastPure Mini Colofnau-G i mewn i'r Tiwbiau Casglu 2 ml, trosglwyddwch yn ofalus yr ateb uchafswm o 700 μL unwaith y
amser i'r colofnau hidlo, centrifuge ar 12,000 rpm (13,800 X g) am 30-60 eiliad.
4. Taflwch y hidlydd ac ychwanegu 300 μL o CMC Clustog i'r golofn, deor ar dymheredd ystafell am 1 munud, centrifuge ar 12,000 rpm (13,800 X g) am 30-60 eiliad.
5. Taflwch y hidlif ac ychwanegwch 700 μL o Buffer GW (gwiriwch a yw ethanol absoliwt wedi'i ychwanegu ymlaen llaw!) i'r golofn, centrifuge ar 12,000 rpm (13,800 X g) am 30-60 eiliad.
Δ Ychwanegwch Buffer GW o amgylch wal y golofn arsugniad, neu ychwanegwch glawr cefn Buffer GW a'i gymysgu wyneb i waered am 2 - 3 gwaith i helpu i fflysio'r halen sy'n glynu wrth wal y tiwb yn llwyr.
6. Ailadroddwch gam 5.
Δ Gall fflysio â Buffer GW ddwywaith sicrhau bod yr halen yn cael ei dynnu'n llwyr a dileu'r effaith ar arbrofion dilynol.
7. Taflwch y hidlydd a centrifuge y golofn wag ar 12,000 rpm (13,800 X g) am 2 funud.
8. Mewnosodwch y golofn i mewn i diwb microcentrifuge glân 1.5 ml, ychwanegu 20 - 30 μL o Elution Buffer i ganol y bilen golofn, deor am 2 funud, ac yna centrifuge ar 12,000 rpm (13,800 X g) am 1 munud.Taflwch y golofn, storio'r DNA a gafwyd ar -20 .
Δ Mae’n bosibl y bydd trosglwyddo’r uwchnatydd yng ngham 8 i’r golofn i eliwt eto a chynhesu’r Byffer Elution i 55 (pan fydd darn DNA >3 kb) o gymorth i gynyddu’r effeithlonrwydd adfer.
Rhaglen adfer cynhyrchion PCR
Mae'r protocol hwn yn berthnasol i buro darnau DNA o gynhyrchion PCR, system adwaith ensymatig a chynhyrchion crai DNA eraill (gan gynnwys DNA genetig).Gall yr hydoddiant hwn gael gwared ar niwcleotidau amrywiol, paent preimio, dimers preimio, moleciwlau halen, ensymau ac amhureddau eraill yn effeithlon.
1. Yn fyr centrifuge cynhyrchion PCR, ateb adwaith enzymatic, a chynhyrchion crai DNA eraill.Amcangyfrifwch eu cyfaint gyda phibed a'i drosglwyddo i diwb 1.5 ml neu 2 ml wedi'i sterileiddio.Ychwanegu ddH2O nes bod y gyfrol hyd at 100 μL;tra ar gyfer DNA genomig gyda chrynodiad uchel, bydd gwanhau i 300 μL gyda ddH2O yn helpu i wella effeithlonrwydd adferiad.
2. Ychwanegwch 5 cyfrol o GDP Buffer, cymysgwch yn drylwyr trwy wrthdroi neu fortecs.Os bydd darn DNA o ddiddordeb >100 bp, mae angen ychwanegu 1.5 cyfaint ychwanegol (samplau + CMC byffer) o ethanol.
3. Rhowch y golofn yn ôl yn y tiwb casglu, trosglwyddwch y mixtrue i'r golofn, centrifuge ar 12,000 rpm (13,800 × g) am 30 - 60 eiliad.Os yw cyfaint yr hydoddiant cymysg yn >700 µL, rhowch y golofn arsugniad yn ôl i'r tiwb casglu, trosglwyddwch yr hydoddiant sy'n weddill i'r golofn arsugniad, a'r centrifuge ar 12,000 rpm (13,800 × g) am 30 - 60 eiliad.
4. Mae'r perfformiad nesaf yn cyfeirio at gam 5 – 8 o raglen echdynnu 08- 1/Gel.
Ceisiadau
Crynodiad amrywiol o gel agarose TAE neu TBE;Cynhyrchion PCR, systemau adwaith ensymatig neu gynhyrchion DNA crai eraill a geir trwy amrywiol ddulliau.Roedd darnau a adferwyd yn amrywio o70 bp -20 kb.
Nodiadau
At ddefnydd ymchwil yn unig.Ddim i'w ddefnyddio mewn gweithdrefnau diagnostig.
1. Ychwanegwch 80 ml o ethanol i wanhau Buffer GW fel y nodir ar y tag cyn ei ddefnyddio, a'i storio ar dymheredd yr ystafell.
2. Os yw'r CMC Buffer yn hawdd i'w waddodi yn ystod storio tymheredd isel, gellir ei osod ar dymheredd yr ystafell am gyfnod o amser cyn ei ddefnyddio.Os oes angen, gellir ei gynhesu ymlaen llaw mewn baddon dŵr 37 ℃ nes bod y gwaddod wedi'i doddi'n llwyr, ac yna gellir ei ddefnyddio ar ôl cymysgu.
3. Gosodwch dymheredd y baddon dŵr i 50 ~ 55 ℃ ymlaen llaw.
4. Yng ngham 1 rhaglen echdynnu 08-1/Gel, bydd lleihau maint y sleisen gel yn lleihau'n sylweddol yr amser hydoddi ac yn cynyddu effeithlonrwydd adfer (Mae DNA llinol yn hawdd i'w hydroleiddio pan fydd yn agored yn barhaus ar dymheredd uchel).Peidiwch â datgelu gel DNA i UV am amser hir, oherwydd gall golau uwchfioled achosi difrod DNA.
5. Toddwch y gel yng ngham 2 rhaglen echdynnu 08- 1/Gel yn gyfan gwbl, fel arall bydd yr effeithlonrwydd adfer DNA yn cael ei effeithio'n ddifrifol.
6. Preheat Elution Buffer neu ddH2O i 55 ℃, sy'n ddefnyddiol i wella effeithlonrwydd elution DNA.Argymhellir storio DNA mewn eluent o 2.5 mM Tris-HCl, pH 7.0 - 8.5.
