Trawsgrifiad Gwrthdroi RTL
Mae RTL reverse transcriptase yn bolymeras DNA sy'n dibynnu ar dempled RNA nad oes ganddo'r gweithgaredd exonuclease 3'→5' ac sydd â gweithgaredd RNase H.Gall yr ensym hwn ddefnyddio RNA fel templed i syntheseiddio llinyn cyflenwol o DNA, y gellir ei gymhwyso i synthesis cDNA llinyn cyntaf, yn enwedig ar gyfer RT-LAMP (ymhelaethiad isothermol trwy gyfrwng dolen).O'i gymharu â thrawsgrifiad gwrthdro RTL 1.0, mae'r sensitifrwydd wedi'i wella'n sylweddol, mae'r sefydlogrwydd thermol yn gryfach, ac mae'r adwaith ar 65 ° C yn fwy sefydlog.Gellir defnyddio trawsgrifiad gwrthdro RTL (heb glycerol) i baratoi paratoadau lyophilized, adweithyddion RT-LAMP lyophilized ac ati.
Diffiniad Uned
Mae un uned yn ymgorffori 1 nmol o dTTP mewn defnydd sy'n gwaddodi ag asid mewn 20 munud ar 50°C gan ddefnyddio poly(A)•oligo(dT)25 fel patrymlun preimiwr.
Cydrannau
| Cydran | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Reverse Transcriptase (di-Glyserol) (15U/μL) | 0.1 ml | 1 ml | 10 ml |
| Clustogfa RTL 10 × HC | 1.5 mL | 4 × 1.5 ml | 5 × 10 ml |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 mL | 2 × 1.5 ml | 3 × 10 ml |
Cyflwr Storio
Cludo o dan 0 ° C a chael ei storio ar -25 ° C ~ -15 ° C.
Rheoli Ansawdd
- Gweithgarwch Gweddilliol oEndoniwcleas:Mae adwaith 50 μL sy'n cynnwys 1 μg o λDNA a 15 uned o RTL2.0 deor am 16 awr ar 37 ℃ yn dangos yr un patrwm â rheolaeth negyddol gan electrofforesis gel.
- Gweithgarwch Gweddilliol oExonuclease:Mae adwaith 50 μL sy'n cynnwys 1 μg o Hind Ⅲ λDNA wedi'i dreulio a 15 uned o RTL2.0 wedi'i ddeor am 16 awr ar 37 ℃ yn dangos yr un patrwm â rheolaeth negyddol gan electrofforesis gel.
- Gweithgarwch Gweddilliol oNickase:Mae adwaith 50 μL sy'n cynnwys 1 μg o pBR322 supercoiled a 15 uned o RTL2.0 wedi'u deor am 4 awr ar 37°C yn dangos yr un patrwm â rheolaeth negyddol gan electrofforesis gel.
- Gweithgarwch Gweddilliol oRNase:Mae adwaith 10 μL sy'n cynnwys 0.48 μg o MS2 RNA a 15 uned o RTL2.0 wedi'u deor am 4 awr ar 37°C yn dangos yr un patrwm â rheolaeth negyddol gan electrofforesis gel.
- E. coli gDNA:Wedi'i fesur gydaE.colipecynnau canfod HCD penodol, mae 15 uned o RTL2.0 yn cynnwys llai nag 1E. coligenom.
Gosod Adwaith
Protocol Synthesis cDNA
| Cydrannau | Cyfrol |
| Templed RNA a | dewisol |
| Oligo(dT) 18 ~ 25 (50uM) neu gymysgedd ar hap Primer (60uM) | 2 μL |
| Cymysgedd dNTP (10mM yr un) | 1 μL |
| Atalydd RNase (40U/uL) | 0.5 μL |
| Trawsgrifiad Gwrthdroi RTL 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| Clustogfa RTL 10 × HC | 2 μL |
| Dŵr Di-Niwclews | Hyd at 20 μL |
Nodiadau:
1) Y dos a argymhellir o Gyfanswm RNA yw 1ng ~ 1μg
2) Y dos a argymhellir o mRNA oedd 50ng ~ 100ng
Thermo-beicio Amodau ar gyfer trefn arferol adwaith:
| Tymheredd (°C) | Amser |
| 25 °Ca | 5 munud |
| 55 °C | 10 munudb |
| 80 °C | 10 munud |
Nodiadau:
1) Os defnyddir Random Primer Mix, cam deori ar 25 ° C.
2) Os defnyddir cymysgedd preimio targed, cam deori ar 55 ° C am 10 ~ 30 munud.
Protocol RT-LAMP
| Cydrannau | Cyfrol | Crynhoad Terfynol |
| Templed RNA | dewisol | ≥10 copi |
| Cymysgedd dNTP (10mM) | 3.5 μL | 1.4 mM |
| Preimwyr FIP/BIP (25×) | 1 μL | 1.6 μM |
| Preimwyr F3/B3 (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| Preimwyr LoopF/LoopB (25×) | 1 μL | 0.4 μM |
| Atalydd RNase (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U/Ymateb |
| Trawsgrifiad Gwrthdroi RTL 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 U/Ymateb |
| Bst V2 DNA Polymerase (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Ymateb |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 μL | 6 mM (Cyfanswm 8 mM) |
| Clustogfa RTL 10 × HC (neu glustog 10 × HC Bst V2) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Dŵr Di-Niwclews | Hyd at 25 μL | - |
Nodiadau:
1) Cymysgwch trwy vortexing a centrifuge yn fyr i'w gasglu.Deor tymheredd cyson ar 65 ° C am 1 awr.
2) Mae'r ddau glustog yn rhyngweithredol ac mae ganddynt yr un cyfansoddiad.
Nodiadau
1. Bydd y cynnyrch hwn yn ffurfio solid gwyn pan gaiff ei storio ar -20 ° C.Tynnwch ef allan o -20 ° C a'i roi ar rew am tua 10 munud.Ar ôl toddi, gellir ei ddefnyddio trwy ysgwyd a chymysgu.
2.Gellid storio'r cynnyrch cDNA ar -20°C neu -80°C neu ei ddefnyddio ar unwaith ar gyfer adwaith PCR.
3.Er mwyn atal halogiad RNase, cadwch yr ardal arbrofol yn lân, a gwisgwch fenig a masgiau glân yn ystod y llawdriniaeth.
