Plannu Pecyn PCR uniongyrchol
Cat Rhif: HCR2020A
Mae Pecyn PCR Plant Uniongyrchol yn addas ar gyfer ymhelaethu'n uniongyrchol ar ddail planhigion, hadau, ac ati, a gellir ei ddefnyddio ar gyfer sgrinio trwybwn uchel o samplau planhigion nad ydynt yn cynnwys polysacaridau a pholyffenolau.Mae gan yr ymhelaethiad uniongyrchol DNA polymeras sy'n seiliedig ar yr esblygiad cyfeiriedig oddefgarwch uwch i atalyddion PCR mewn planhigion.Yn y cyfamser, mae'n cynnal y perfformiad ymhelaethu uchel, sy'n addas ar gyfer ymhelaethu darnau DNA o fewn 5 kb.Gellir defnyddio'r byffer Lysis A unigryw yn y pecyn i lyse meinweoedd planhigion ffres neu wedi'u rhewi.Mae'n hawdd ei weithredu a gellir defnyddio'r lysate fel templed ar gyfer ymhelaethu heb buro.Mae'r system yn cynnwys cyfryngau amddiffynnol sy'n galluogi samplau crai i gael eu chwyddo'n effeithiol ar ôl rhewi a dadmer dro ar ôl tro.Dim ond ychwanegu paent preimio a thempledi y mae angen i 2 × Plant Direct Master Mix ei wneud i berfformio adwaith mwyhau, a thrwy hynny leihau gweithrediadau pibellau a gwella trwygyrch canfod ac atgynhyrchu canlyniadau.
Cydrannau
| Cydrannau | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Cymysgedd Meistr Planhigion Uniongyrchol | 1.25 ml | 4 × 1.25 ml |
| Clustogfa Lysis Plant Uniongyrchol A | 5 ml | 20 ml |
| Clustogfa Lysis Plant Uniongyrchol B* | 5 ml | 20 ml |
* Mae Clustogi Planhigion Uniongyrchol Lysis B yn adweithydd dewisol, a ddefnyddir i niwtraleiddio Clustog A Lysis Plant Uniongyrchol ar gyfer ymestyn amser storio samplau.Gellir ei ddefnyddio yn ôl y sefyllfa wirioneddol.
Amodau Storio
2 × Cymysgedd Meistr Planhigion Uniongyrchol, storio ar -30 ~ -15 ℃ ac osgoi rhewi a dadmer dro ar ôl tro;Clustogi Planhigion Uniongyrchol Lysis, storio ar -30 ~ -15 ℃ neu 2 ~ 8 ℃.
Proses Arbrawf
Prosesu Sampl-Deilen Planhigyn
Dull uniongyrchol:Argymhellir defnyddio dail ifanc.Defnyddiwch dyrnu twll gyda diamedr sefydlog o 0.5 - 3 mm i gael sampl bach ac unffurf, ac yna ychwanegwch y sampl yn uniongyrchol i'r system PCR (argymhellir system 50 μl).Sylwch, gwnewch yn siŵr bod y sampl yn yr ateb PCR ac nid yn erbyn wal y tiwb.Os defnyddir PCR uniongyrchol i chwyddo darnau hir a samplau cymhleth, gall defnyddio sampl â diamedr llai (0.5 – 1 mm) fel templed helpu i gael canlyniadau gwell.
Dull malu lysis:Argymhellir defnyddio dail ifanc.Cymerwch ddarn bach o ddeilen (tua 1 - 3 mm mewn diamedr), rhowch ef yn 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, a'i falu cymaint â phosib (gellir gwneud y cam hwn trwy wasgu'r ddeilen gyda blaen pibed 100 μl i stwnsio'r sampl).Os defnyddir cyfeintiau mwy o feinwe dail (peidiwch â bod yn fwy na 7 mm), cynyddwch gyfaint y byffer gwanhau i 50 μl.Ar ôl i'r dail fod yn ddaear, dylai'r toddiant ymddangos yn wyrdd.Ar ôl allgyrchiad byr, ychwanegwch 1 µl o'r uwchnatur i'r system PCR fel templed adwaith .
Dull lysis thermol:Argymhellir defnyddio dail ifanc.Cymerwch ddarn bach o ddeilen (tua 1 - 3 mm mewn diamedr), rhowch ef yn 20 μl Clustogfa Lysis A Plant Uniongyrchol, a'i gynhesu ar 95 ° C am 5 - 10 munud.Gellir ymestyn yr amser lysis yn briodol ar gyfer dail sy'n anodd eu lyse (dim mwy nag 20 munud).Os defnyddir cyfeintiau mwy o feinwe dail (peidiwch â bod yn fwy na 7 mm), cynyddwch gyfaint y byffer gwanhau i 50 μl.Ar ôl gwresogi, centrifuge yn fyr, ac ychwanegu 1 μl o supernatant i'r system PCR fel templateb adwaith.
Prosesu Sampl-Hadau Planhigion
Dull malu lysis:Defnyddiwch sgalpel i dorri hadau â diamedr o 5 mm, eu hychwanegu at 100 μl o Clustog A Lysis Plant Uniongyrchol, a malu'r sampl gyda blaen pibed neu offer eraill.Vortex yn fyr a gadewch i chi sefyll ar dymheredd yr ystafell am 3-5 munud.Sicrhewch fod y sampl hadau wedi'i foddi yn y byffer gwanedu.Ar ôl allgyrchiad byr, ychwanegwch 1 μl o'r uwchnatur i'r system PCR fel templed adwaith.
Dull lysis thermol:Defnyddiwch sgalpel i dorri hadau â diamedr o 5 mm, eu hychwanegu at 100 μl o Clustog A Lysis Plant Uniongyrchol, a'u cynhesu ar 95 ° C am 5 - 10 munud.Gellir ymestyn yr amser lysis yn briodol ar gyfer dail sy'n anodd eu lyse (dim mwy na 30 munud).Ar ôl gwresogi, centrifuge yn fyr, ac ychwanegu 1 μl supernatant i'r system PCR fel templateb adwaith.
a.Gellir defnyddio siswrn neu offer eraill hefyd i dorri samplau o faint addas;os yw'r dyrnu neu'r siswrn yn cael eu hailddefnyddio, dylid eu glanhau â datrysiad sodiwm hypochlorite 2% cyn pob defnydd i atal croeshalogi rhwng samplau.
b.Gwnewch yn siŵr bod y Clustogfa Lysis Plant Direct wedi'i doddi'n llawn cyn ei ddefnyddio.Os yw'r byffer yn gludiog neu os oes ganddo waddodion, gellir ei gynhesu ar 37 ℃ i'w doddi'n llwyr cyn ei ddefnyddio.
c.Gellir addasu cyfaint y templed yn y system adwaith yn briodol yn ôl y gwahaniaeth yng nghyfaint y deunydd planhigion a'r gwanwr a ychwanegir.
Clustogfa Lysis Plant Uniongyrchol
Mae'r Clustogfa Lysis A Planhigion Uniongyrchol a gynhwysir yn y cynnyrch hwn wedi'i optimeiddio'n llym i ryddhau genom y rhan fwyaf o feinweoedd planhigion ac mae'n addas ar gyfer storio planhigion crai yn y tymor byr ar 4 ℃.Os oes angen storio'r sampl am gyfnod hirach o amser (ee, 1 - 2 fis), argymhellir trosglwyddo'r supernatant i diwb EP newydd a'i storio ar -20 ℃.I storio'r samplau'n fwy sefydlog, ychwanegwch gyfaint cyfartal o Byffer Lysis B Plant Uniongyrchol i'r supernatant a drosglwyddwyd, cymysgwch yn dda a'i storio ar -20 ℃.Mae'r amser storio sefydlog yn amrywio yn ôl samplau planhigion a chyflyrau.
System Adwaith
| ddH2O | I 20.0 µl | I 50.0 µl |
| 2 × Cymysgedd Meistr Planhigion Uniongyrchola | 10.0 µl | 25.0 µ |
| Preimiwr 1 (10 µM) | 0.8 µl | 2.0 µl |
| Preimiwr 2 (10 µM)b | 0.8 µl | 2.0 µl |
| Sampl dail planhigion / echdynnu crai(Cyfeiriwch at Brosesu Sampl) | Disg deilen 0.5 – 3 mm/x µl | Disg deilen 0.5 – 3 mm/x µl |
a.Mae'n cynnwys Mg2+ar grynodiad terfynol o 2 mM.
b.Argymhellir defnyddio crynodiad terfynol o 0.4μM ar gyfer pob paent preimio.Bydd defnydd gormodol o breimwyr yn arwain at fwy o ymhelaethu amhenodol.
c.Gellir addasu faint o sampl a ddefnyddir yn ôl y sefyllfa wirioneddol.Gellir addasu'r swm a ddefnyddir mewn un adwaith o sampl crai lysed rhwng 2% - 20% o gyfanswm cyfaint yr adwaith.Gall defnyddio gormod o samplau achosi methiant ymhelaethu.
Rhaglen Ymateb
| Camau | Tymheredd | Amser |
| Dadnatureiddio Cychwynnol | 98 ℃ | 5 mun |
| Dadnatureiddio | 95 ℃ | 10 eiliad |
| Anelio | 58 ~ 72 ℃ | 15 eiliad |
| Estyniad | 72 ℃ | 30 eiliad |
| Estyniad Terfynol | 72 ℃ | 5 mun |
a.Mae Dadnatureiddio Cychwynnol (98 ℃, 5 munud) yn hyrwyddo lysis meinwe planhigion, gan ryddhau DNA genomig y gellir ei ddefnyddio ar gyfer ymhelaethu PCR.Peidiwch â byrhau'r amser na gostwng y tymheredd.
b.Argymhellir ei osod yn hafal i'r gwerth primer Tm neu 2 ~ 4 ℃ yn uwch na'r gwerth Tm.Mae'r ymhelaethiad uniongyrchol DNA polymeras a ddefnyddir yn y cynnyrch hwn yn wahanol i confensiynol Taq DNA polymeras, ac mae ganddo ofynion arbennig ar gyfer tymheredd anelio adwaith ； gall defnyddio tymheredd anelio uchel leihau ymhelaethu amhenodol yn effeithiol a gwella'r effeithlonrwydd ymhelaethu.Ar gyfer templedi cymhleth, gellir cyflawni'r ymhelaethiad effeithlon trwy addasu tymheredd anelio ac ymestyn amser ymestyn.
c.Os yw hyd y cynnyrch ymhelaethu yn ≤1 kb, mae'r amser ymestyn wedi'i osod ar 30 sec / kb;os yw hyd y cynnyrch ymhelaethu yn > 1 kb, mae'r amser ymestyn wedi'i osod ar 60 sec/kb.
d.Ar gyfer samplau cymhleth neu samplau â chynnyrch ymhelaethu isel, gellir cynyddu nifer y cylchoedd yn briodol i 40 -50 cylch.
Ceisiadau
Mae'n berthnasol ar gyfer ymhelaethu'n uniongyrchol ar feinweoedd planhigion a sgrinio trwybwn uchel o samplau planhigion nad ydynt yn cynnwys polysacaridau a pholyffenolau.
Nodiadau
At ddefnydd ymchwil yn unig.Ddim i'w ddefnyddio mewn gweithdrefnau diagnostig.
1. Ar gyfer ymhelaethu planhigion crai neu ymhelaethu uniongyrchol, argymhellir defnyddio DNA genomig wedi'i buro fel rheolaeth gadarnhaol cyn dechrau'r arbrawf i sicrhau bod y system, y paent preimio a'r gweithrediadau yn gywir.
2. Mae gan y polymeras DNA ymhelaethu uniongyrchol a ddefnyddir yn y pecyn hwn weithgaredd prawfddarllen cryf.Os oes angen clonio TA, argymhellir puro'r DNA cyn ychwanegu'r adenin.
3. Canllaw Dylunio Primer:
a.Argymhellir y dylai'r sylfaen olaf ar ben 3′ y paent preimio fod yn G neu C.
b.Dylid osgoi anghysondebau olynol yn yr 8 gwaelod olaf ar ben 3′ y paent preimio.c.Osgowch strwythurau pin gwallt ar ben 3′ y paent preimio.
d.Ni ddylai gwahaniaethau yng ngwerth Tm y preimiwr blaen a'r preimiwr cefn fod yn fwy na 1 ℃ a dylid addasu'r gwerth Tm i 60 ~ 72 ℃ (argymhellir Primer Premier 5 i gyfrifo'r gwerth Tm).
e.Ni ddylid cynnwys dilyniannau paent preimio ychwanegol nad ydynt wedi'u paru â'r templed wrth gyfrifo gwerth Tm preimio.
dd.Argymhellir bod cynnwys GC y paent preimio i fod yn 40% -60%.
g.Dylai dosbarthiad cyffredinol A, G, C a T yn y paent preimio fod mor wastad â phosibl.Ceisiwch osgoi defnyddio rhanbarthau sydd â chynnwys GC neu AT uchel.
h.Osgoi presenoldeb dilyniannau cyflenwol o 5 neu fwy o fasau naill ai o fewn y paent preimio neu rhwng dau primer ac osgoi presenoldeb dilyniannau cyflenwol o 3 bas neu fwy ar ben 3′ dau primer.
ff.Defnyddiwch swyddogaeth NCBI BLAST i wirio penodoldeb y paent preimio i atal ymhelaethu amhenodol.
