Proteinas K mNGS (hylif)
Mae Proteinase K yn broteas serine sefydlog gyda phenodoldeb swbstrad eang.Mae'n diraddio llawer o broteinau yn y cyflwr brodorol hyd yn oed ym mhresenoldeb glanedyddion.Mae tystiolaeth o astudiaethau adeiledd grisial a moleciwlaidd yn dangos bod yr ensym yn perthyn i'r teulu subtilisin gyda thriad catalytig safle actif (Asp39-Ei69-Ser224).Prif safle holltiad yw'r bond peptid sy'n gyfagos i'r grŵp carboxyl o asidau amino aliffatig ac aromatig gyda grwpiau alffa amino wedi'u blocio.Fe'i defnyddir yn gyffredin am ei benodolrwydd eang.Mae'r proteinase K hwn wedi'i gynllunio'n arbennig ar gyfer mNGS.O'i gymharu â'r proteinase K arall, mae'n cynnwys hyd yn oed llai o halogiad asid niwclëig gyda'r un perfformiad ensymatig, a allai sicrhau'n well y cymhwysiad mNGS i lawr yr afon.
Amodau Storio
2-8 ℃ am 2 flynedd
Manyleb
| Ymddangosiad | Di-liw i hylif brown golau |
| Gweithgaredd | ≥800 U/ml |
| Crynodiad Protein | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Dim wedi'i ganfod |
| DNA | Dim wedi'i ganfod |
| RNase | Dim wedi'i ganfod |
Priodweddau
| Rhif CE | 3.4.21.64(Ailgyfunol o albwm Tritirachium) |
| Pwynt isoelectrig | 7.81 |
| pH optimwm | 7.0- 12.0 Ffig |
| Tymheredd gorau posibl | 65 ℃ Ffig |
| sefydlogrwydd pH | pH 4.5- 12.5 (25 ℃, 16 h) Ffig. 3 |
| Sefydlogrwydd thermol | Islaw 50 ℃ (pH 8.0, 30 mun) Ffig |
| Sefydlogrwydd storio | Gweithgaredd dros 90% am 12 mis ar 25 ℃ |
| Actifyddion | SDS, wrea |
| Atalyddion | Diisopropyl fflworophosphate;fflworid ffenylmethylsulfonyl |
Ceisiadau
1. Pecyn diagnostig genetig
2. Pecynnau echdynnu RNA a DNA
3. Echdynnu cydrannau nad ydynt yn brotein o feinweoedd, diraddio amhureddau protein, megis DNAbrechlynnau a pharatoi heparin
4. Paratoi DNA cromosom trwy electrofforesis pwls
5. blotyn gorllewinol
6. Diagnosis in vitro adweithyddion albwmin glycosylaidd ensymatig
Rhagofalon
Gwisgwch fenig amddiffynnol a gogls wrth ddefnyddio neu bwyso, a chadwch nhw wedi'u hawyru'n dda ar ôl eu defnyddio.Gall y cynnyrch hwn achosi adwaith alergaidd i'r croen a llid llygaid difrifol.Os caiff ei anadlu, gall achosi symptomau alergedd neu asthma neu ddyspnea.Gall achosi llid anadlol.
Diffiniad uned
Diffinnir un uned (U) fel swm yr ensym sydd ei angen i hydrolyze casein i gynhyrchu 1 μmoltyrosine y funud o dan yr amodau canlynol.
Paratoi adweithyddion
Adweithydd I: Diddymwyd 1g casein llaeth mewn 50ml o hydoddiant sodiwm ffosffad 0.1M (pH 8.0), wedi'i ddeor mewn dŵr 65-70 ℃ am 15 munud, wedi'i droi a'i doddi, ei oeri gan ddŵr, wedi'i addasu gan sodiwm hydrocsid i pH 8.0, a chyfaint sefydlog 100ml.
Adweithydd II: asid trichloroacetig 0.1M, asetad sodiwm 0.2M, asid asetig 0.3M.
Adweithydd III: 0.4M Na2CO3ateb.
Adweithydd IV: Adweithydd Forint wedi'i wanhau â dŵr pur am 5 gwaith.
Adweithydd V: Diluent ensymau: hydoddiant sodiwm ffosffad 0.1M (pH 8.0).
Adweithydd VI: toddiant tyrosin: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml tyrosin wedi'i hydoddi â 0.2M HCl.
Gweithdrefn
1. Mae 0.5ml o adweithydd I wedi'i gynhesu ymlaen llaw i 37 ℃, ychwanegu 0.5ml o hydoddiant ensym, cymysgu'n dda, a deor yn37 ℃ am 10 munud.
2. Ychwanegwch 1ml o adweithydd II i atal yr adwaith, ei gymysgu'n dda, a pharhau i ddeor am 30 munud.
3. Centrifugate adwaith adwaith.
4. Cymerwch 0.5ml supernatant, ychwanegu 2.5ml adweithydd III, 0.5ml adweithydd IV, cymysgu'n dda a deor ar 37 ℃am 30 munud.
5. OD660ei benderfynu fel OD1;grŵp rheoli gwag: defnyddir adweithydd 0.5ml V i ddisodli ensymdatrysiad i bennu OD660fel OD2, OD=OD1-OD2.
6. Cromlin safonol L-tyrosine: 0.5mL crynodiad gwahanol hydoddiant L-tyrosine, 2.5mL Adweithydd III, 0.5mL Adweithydd IV mewn tiwb allgyrchydd 5mL, deor mewn 37 ℃ am 30 munud, canfod ar gyfer OD660ar gyfer crynodiadau gwahanol o L-tyrosine, yna cael y gromlin safonol Y=kX+b, lle Y yw'r crynodiad L-tyrosin, X yw OD600.
Cyfrifiad
2: Cyfanswm cyfaint yr ateb adwaith (mL)
0.5: Cyfaint hydoddiant ensym (mL)
0.5: Cyfaint hylif adwaith a ddefnyddir mewn penderfyniad cromogenig (mL)
10: Amser ymateb (munud)
Df: gwanhau lluosog
C: Crynodiad ensymau (mg/mL)
Cyfeiriadau
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Bioffys.Res.Cymmun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Eur.J. Biochem.(1975);56:103-108.
4. Sambrook Jet al., Clonio Moleciwlaidd: Llawlyfr Labordy, 2il argraffiad, Cold Spring HarbourLabordy Press, Cold Spring Harbour (1989).
Ffigurau
Ffig.1 optimwm pH
Datrysiad byffer 100mM: pH6.0-8.0, Na-ffosffad;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glycine-NaOH. Crynodiad ensymau: 1mg/mL
Ffig.2 Tymheredd optimwm
Adwaith mewn byffer K-ffosffad 20 mM pH 8.0.Crynodiad ensymau: 1 mg/ml
Ffig.3 pH Sefydlogrwydd
25 ℃, 16 h-driniaeth gyda datrysiad byffer 50 mM: pH 4.5- 5.5, Asetad;pH 6.0-8.0, Na-ffosffad;pH 8.0-9.0, Tris-HCl.pH 9.0- 12.5, Glycine-NaOH.Crynodiad ensymau: 1 mg/ml
Ffig.4 Thermol sefydlogrwydd
Triniaeth 30 munud gyda byffer Tris-HCl 50 mM, pH 8.0.Crynodiad ensymau: 1 mg/ml
Ffig.5 Storio sefydlogity at 25 ℃
